Wittchen, Manuel: Transkriptomsequenzierung bei Corynebakterien zur Charakterisierung von Mutanten in der RNA-Synthese und im RNA-Abbau. 2018
Inhalt
- Abkürzungsverzeichnis
- 1 Zusammenfassung
- 2 Theoretischer Hintergrund
- 2.1 Taxonomie der Corynebakterien
- 2.1.1 Medizinische Relevanz von Corynebacterium diphtheriae
- 2.1.2 Corynebacterium glutamicum als industriell genutztes Bakterium
- 2.2 Transkriptionsinitiation in Bakterien
- 2.3 Rho-abhängige Transkriptionstermination
- 2.3.1 Prinzip der Rho-abhängigen Transkriptionstermination
- 2.3.2 Struktur des Rho-Faktors
- 2.3.3 Verbreitung des Rho-Faktors und weitere Funktionen
- 2.4 Prokaryotische Transkript-Degradation
- 2.4.1 Transkript-Degradation in gramnegativen und grampositiven Bakterien
- 2.4.2 Regulation der Transkript-Degradation
- 2.5 RNA-Sequenzierung zur Transkriptomanalyse
- 2.6 Ziele der Arbeit
- 2.7 Bisherige Publikationen
- 3 Material und Methoden
- 3.1 Bakterienstämme, Plasmide und Primer
- 3.2 Verwendete Chemikalien, Materialien, Geräte und Software
- 3.3 Medien und Lösungen
- 3.4 Kultivierung und Lagerung von Bakterien
- 3.5 Bestimmung des Bakterientiters
- 3.6 Allgemeine DNA-Arbeiten
- 3.6.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- 3.6.2 Isolierung von DNA
- 3.6.3 Agarose-Gelelektrophorese
- 3.6.4 DNA-Aufreinigung und -Quantifizierung
- 3.6.5 Klonierung mittels Gibson-Assembly
- 3.6.6 Herstellung von kompetenten Zellen
- 3.6.7 Transformation von DNA
- 3.7 Bestimmung der Transformationsfrequenz
- 3.7.1 Durchführen von Gendeletionen
- 3.7.2 Plasmidbasierte Genexpression
- 3.7.3 Insertion von Genen mittels pRIM2-System
- 3.8 Allgemeine Protein-Arbeiten
- 3.8.1 Proteinaufreinigung mit Affinitätschromatographie
- 3.8.2 Proteinquantifizierung mittels Bradford-Test
- 3.8.3 Proteinidentifikation mit SDS-PAGE
- 3.8.4 Proteinidentifikation mit MALDI-ToF/ToF-MS
- 3.9 Allgemeine RNA-Arbeiten
- 3.10 Quantitative Reverse-Transkriptase-PCR
- 3.11 Northern Blot
- 3.12 RNA-Sequenzierung
- 3.12.1 Sequenzierung von Volllängentranskripten
- 3.12.2 Sequenzierung von ribosomaler RNA
- 3.12.3 Sequenzierung der 5'-Enden von Primärtranskripten
- 3.12.4 Sequenzierung von RNase-Schnittstellen mittels RNase-Assay
- 3.13 Bioinformatische Analysen der RNA-Sequenzierungsdaten
- 3.13.1 Qualitätskontrolle und Read-Mapping
- 3.13.2 Bestimmung differenziell transkribierter Gene
- 3.13.3 Identifizierung von Transkriptionsstarts
- 3.13.4 Identifizierung von neuen Transkripten
- 3.13.5 Identifizierung von Operonstrukturen
- 3.13.6 Identifizierung von Sequenzmotiven
- 3.13.7 Identifizierung von verlängerten Transkripten
- 3.13.8 Identifizierung von RNase-Schnittstellen im RNase-Assay
- 4 Ergebnisse
- 4.1 Analyse der Transkriptionsinitiation in Corynebacterium diphtheriae
- 4.1.1 Probengenerierung und Sequenzierung der C. diphtheriae cDNA-Bibliotheken
- 4.1.2 Identifizierung von Transkriptionsstarts
- 4.1.3 Charakterisierung des A Promotormotivs anhand der identifizierten Transkriptionsstarts
- 4.1.4 Die Analyse der 5'-Untranslatierten Regionen ergibt eine für Corynebakterien charakteristische Längenverteilung
- 4.1.5 Verbesserung der Gen-Annotation durch Identifizierung von neuen Transkripten und Korrektur von Translationsstarts
- 4.1.6 Identifizierung von Operon-Strukturen durch die Kombination von Gesamttranskriptom- und TSS-Daten
- 4.1.7 Das Diphtherietoxin kodierende Gen tox besitzt zwei bisher unbekannte antisense Transkripte
- 4.1.8 Vergleichende Analyse der DtxR-regulierten Gene
- 4.2 Rho-abhängige Transkriptionstermination in Corynebacterium glutamicum
- 4.2.1 Vergleich des Rho-Proteins aus C. glutamicum mit den Homologen der Modellorganismen
- 4.2.2 Die Deletion des Rho-Faktor Gens führt zu verlangsamten Wachstum
- 4.2.3 Die Deletion von rho führt zu einer deutlichen Veränderung des Transkriptoms
- 4.2.4 Der Rho-Faktor beeinflusst die Transkription potentieller Fremd-DNA
- 4.2.5 Hinweise auf verlängerte Transkripte in der rho-Mutante
- 4.2.6 Identifizierung von Rho-abhängig terminierten Transkripten
- 4.2.7 Längenanalyse der Rho-abhängig terminierten Transkripte
- 4.2.8 Analyse von Rho utilization sites
- 4.2.9 Die Termination von antisense RNA ist Rho-abhängig
- 4.2.10 Rho reguliert die Termination bestimmter Riboswitches
- 4.2.11 Die Transkription eines Typ IVb Pilus-Gen-Clusters in C. glutamicum ist Rho-abhängig
- 4.2.12 Rho aktiviert die Transkription von Kompetenzgenen
- 4.2.13 Überexpression des Typ IVb Pilus-Gen-Clusters führt zu höherer Transformationsfrequenz
- 4.3 RNA-Degradation durch die RNasen E/G und J in C. glutamicum
- 4.3.1 Vergleich von RNase E/G und RNase J mit Homologen der Modellorganismen
- 4.3.2 Deletion der für die RNasen E/G und J kodierenden Gene und Analyse des Wachstums
- 4.3.3 Die Deletionen der für die RNasen E/G und J kodierenden Gene haben einen starken Einfluss auf das Transkriptom
- 4.3.4 Prozessierung des 5S rRNA Vorläufers durch RNase E/G
- 4.3.5 Entwicklung einer RNA-Sequenzierungsmethode zur Erfassung von RNase-Schnittstellen
- 4.3.6 Endoribonukleolytische mRNA-Degradation durch die RNase E/G
- 4.3.7 Die Hauptfunktion der bifunktionalen RNase J ist der exoribonukleolytische Abbau ausgehend vom 5'-Ende
- 4.3.8 Regulation von Riboswitches und RNA-Motiven durch die RNasen E/G und J
- 5 Diskussion
- 5.1 Primärtranskriptsequenzierung als geeignete Methode zur Analyse der Transkriptionsinitiation
- 5.2 Analyse der Transkriptionsinitiation in Corynebacterium diphtheriae
- 5.2.1 Analyse der genomweit identifizierten Transkriptionsstarts
- 5.2.2 Nachweis neuer potenziell regulativer RNAs
- 5.2.3 Charakterisierung des A Promotormotivs und von regulatorischen Elementen in 5'-UTRs
- 5.2.4 Identifizierung von Operon-Strukturen
- 5.2.5 Analyse des DtxR-Regulons in C. diphtheriae
- 5.2.6 Analyse der Phagen-Insel mit Fokus auf dem Diphtherietoxin-kodierenden Gen tox
- 5.3 Rho-abhängige Transkripttermination in C. glutamicum
- 5.3.1 Vergleich der Struktur des Rho-Faktors aus C. glutamicum
- 5.3.2 Rho reprimiert die Transkription von potenzieller Fremd-DNA
- 5.3.3 Die Deletion von rho führt zu verlängerten Transkripten
- 5.3.4 Identifikation der in der rho-Mutante verlängerten Transkripte
- 5.3.5 Rho terminiert antisense RNAs
- 5.3.6 Rho ist an der Regulation einiger Riboswitches beteiligt
- 5.3.7 Motivanalyse von möglichen rut sites von mRNAs
- 5.3.8 Rho reguliert ein Typ IVb Pilussystem
- 5.4 RNA-Degradation durch die RNasen E/G und J in C. glutamicum
- 5.4.1 C. glutamicum besitzt eine von den Modellorganismen abweichende RNase-Ausstattung
- 5.4.2 Die RNasen E/G und J besitzen zusätzliche N-terminale Bereiche
- 5.4.3 Die RNasen E/G und J nicht essenziell
- 5.4.4 Einfluss der RNasen E/G und J das Transkriptom in C. glutamicum
- 5.4.5 Die Entwicklung des RNase-Assays ermöglicht die Identifizierung von RNase-Schnittstellen
- 5.4.6 Cg.RNase E/G ist an der Initiation der RNA-Degradation beteiligt
- 5.4.7 Cg.RNase E/G schneidet RNA an einem konservierten Motiv
- 5.4.8 RNase J besitzt hauptsächlich Exoribonuklease-Aktivität
- 5.4.9 Prozessierung und Degradation von Riboswitches und anderen regulatorischen Elementen durch die RNasen E/G und J
- 6 Ausblick
- Literaturverzeichnis
- Tabellenverzeichnis
- Abbildungsverzeichnis
- Anhang
- A.1 Ergänzende Abbildungen
- A.2 Ergänzende Tabellen
- A.3 Große ergänzende Tabellen
- A.4 Detaillierte Protokolle der RNase-Assays
- A.5 Quellcode der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Programme
- Danksagung
- Erklärung