Inhalt

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  1 Einleitung
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   1.1 Lysosomen
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   1.1.1 Lysosomale Proteine
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   1.1.2 Synthese und Reifung lysosomaler Proteine
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   1.1.3 Transport lysosomaler Membranproteine
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   1.1.4 Transport lysosomaler Matrixproteine
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   1.1.5 Lysosomen-assoziierte Erkrankungen
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   1.2 Proteine der Ntn-Hydrolase-Superfamilie
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   1.2.1 Das lysosomale Protein Plbd2
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   1.2.2 Das lysosomale Protein Plbd1
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  1.3 Genveränderungen mittels CRISPR-Cas
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   1.3.1 CRISPR-Cas9 als molekulares Werkzeug
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   1.4 Zielsetzung
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  2 Material
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   2.1 Geräte
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   2.2 Verbrauchsmaterial
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   2.3 Chemikalien
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   2.4 Standardpuffer und Medien
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   2.5 Enzyme und Kits
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   2.6 Antikörper
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  2.7 Plasmide und Primer
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   2.7.1 Plasmide
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   2.7.2 Mutagenese- und Klonierungsprimer
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   2.7.3 Genotypisierungs- und Sequenzierprimer
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   2.7.4 Primer zur Genotypisierung von CRISPR-offtarget-Bindestellen (OTS)
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   2.7.5 Einzelsträngige Oligodesoxynukleotide (ssODN) als HDR-Reparaturvorlage
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   2.7.6 Quantitative-Real-Time-PCR Primer
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   2.8 Eukaryotische Zelllinien
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   2.9 EDV
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  3 Methoden
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  3.1 Molekularbiologische Methoden
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   3.1.1 Isolierung und Reinigung von RNA
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   3.1.2 cDNA-Synthese
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   3.1.3 Isolierung von genomischer DNA
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   3.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
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   3.1.5 Trennung von DNA in Agarosegelen
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   3.1.6 Trennung von DNA in Polyacrylamidgelen
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   3.1.7 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
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   3.1.8 Restriktionsverdau und Dephosphorylierung
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   3.1.9 Ligation
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   3.1.10 TA-Klonierung
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   3.1.11 Herstellung kompetenter Bakterien
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   3.1.12 Transformation von Bakterien durch Hitzeschock
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   3.1.13 Transformation von Bakterien durch Elektroporation
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   3.1.14 Aufreinigung von Plasmid-DNA
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   3.1.15 Sequenzierung
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   3.1.16 Mutationsanalyse mit T7-Endonuklease I
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  3.2 Proteinbiochemische Methoden
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   3.2.1 Gewinnung von Zelllysaten aus Zellpellets
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   3.2.2 Anreicherung von Zellorganellen aus Zellhomogenaten
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   3.2.3 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
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   3.2.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
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   3.2.5 Western-Blot und Immundetektion von Proteinen
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   3.2.6 Reinigen, Trocknen und Reaktivieren von PVDF-Membranen
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   3.2.7 Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen
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   3.2.8 Deglykosylierung mit N-Glykosidase F
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   3.2.9 Percoll™-Dichtegradienten-Zentrifugation
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   3.2.10 Herstellung von Lysosomen-angereicherter Fraktion aus muriner Leber (Tritosomen)
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   3.2.11 Proteinaufreinigung mittels Ni2+-NTA-Agarose
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   3.2.12 Umpuffern mittels Centricon
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   3.2.13 Aktivitätsassays lysosomaler Hydrolasen
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  3.3 Zellbiologische Methoden
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   3.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen
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   3.3.2 Kryokonservierung und Revitalisierung
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   3.3.3 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen
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   3.3.4 Einzelzell-Klonierung durch serielle Verdünnung
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   3.3.5 Ernte von konditioniertem Medium mit sekretierten lysosomalen Proteinen
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   3.3.6 Beschichtung von Deckgläsern mit poly-L-Lysin
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   3.3.7 Indirekte Immunfluoreszenz-Färbung von kultivierten Zellen
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  3.4 Tierexperimentelle und histologische Methoden
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   3.4.1 Erzeugung von knockout-Mäusen
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   3.4.2 Genotypisierung der erzeugten Mauslinien
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   3.4.3 Erzeugung von Gewebehomogenaten
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   3.4.4 Gewinnung und Immortalisierung von murinen embryonalen Fibroblasten
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   3.4.5 Gewinnung von Knochenmarkszellen und Differenzierung zu Makrophagen
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   3.4.6 Gewinnung von EDTA-Blut und Isolierung von Leukozyten
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   3.4.7 Perfusion mit Paraformaldehyd zur Fixierung
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   3.4.8 Herstellung von Gefrier-Gewebeschnitten
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   3.4.9 Herstellung von Paraffin-Gewebeschnitten
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   3.4.10 Indirekte Immunfluoreszenz-Färbungen auf Gewebeschnitten
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   3.4.11 Hämatoxilin-Eosin (HE)-Färbung von Gewebeschnitten
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   4 Ergebnisse
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   4.1 Autokatalytische Prozessierung des Plbd2
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   4.1.1 Spaltungsmuster des Plbd2 in vivo
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   4.1.2 Analyse der putativ autokatalytisch inaktiven Mutanten C249S und C249A
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   4.1.3 Autokatalytische Prozessierung in vitro
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   4.2 Proteolytische Spaltung des Plbd2 βFragments
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   4.2.1 Einfluss von Protease-Inhibitoren auf die Spaltung
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   4.2.2 Lokalisation der Spaltstelle durch Mutationsanalyse
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   4.2.3 Zeitabhängige Prozessierung von Plbd2 und Plbd2-N394Q
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   4.2.4 Klonierung und Aufreinigung von murinem CtsB, CtsL, AEP und Plbd2
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   4.2.5 Aktivierung von rekombinantem CtsB, CtsL und AEP
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   4.2.6 In vitro Umsatz von Plbd2 mit CtsB, CtsL oder Tritosomen
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   4.2.7 In vitro Prozessierung von Plbd2 durch CtsB, CtsL und AEP
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  4.3 Intrazelluläre Sortierung des Plbd2
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   4.3.1 Sortierung des Plbd2 bei Defekten im M6P-Transportweg
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   4.3.2 Lokalisation des Plbd2 in Zelllinien mit Sortierungsdefekten
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   4.3.3 Subzelluläre Fraktionierung durch Dichtegradienten-Zentrifugation
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  4.4 Erzeugung von Plbd1- und Plbd2-knockout- Mausmodellen
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   4.4.1 Klonierung und Validierung von Guide-RNAs in Zellkultur
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   4.4.2 Isolierung von putativ mutierten Zellklonen
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   4.4.3 Erzeugung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Mausmodellen
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   4.4.4 Etablierung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Inzuchtstämmen und Validierung der Mutationen auf genomischer Ebene
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   4.4.5 Validierung der knockout-Mausmodelle auf Transkript-Ebene
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   4.4.6 Validierung der knockout-Mausmodelle auf Protein-Ebene in angereicherten Lysosomen und Geweben
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   4.4.7 Analyse von Blutzellen aus der Plbd1-/--Mauslinie
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   4.4.8 Expression von Plbd1 und Plbd2 in Makrophagen und Knochenmarkszellen
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   4.4.9 Histologie und indirekte Immunfluoreszenz in Hoden aus Plbd1-KO-Mäusen
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   4.4.10 Indirekte Immunfluoreszenz in WT- und Plbd2-KO-Gewebe
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   5 Diskussion
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  5.1 Autokatalytische Prozessierung des Pro-Plbd2
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   5.1.1 Plbd2-WT, aber nicht die Mutante-C249S, wird in vitro autokatalytisch gespalten
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   5.1.2 Die Plbd2-C249S-Mutante wird intrazellulär proteolytisch gespalten
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   5.1.3 Das Pro-α-Fragment wird proteolytisch verkürzt
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   5.1.4 Die Inkubation mit Tritosomen verstärkt die autokatalytische Spaltung
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   5.2 Prozessierung des β-Fragments
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   5.2.1 Die Proteasen AEP, CtsB und CtsL sind an der Spaltung des β-Fragments beteiligt
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   5.2.2 Die proteolytische Spaltung findet an Asn394 statt
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   5.2.3 Plbd2-Prozessierung mit rekombinanten Proteasen in vitro
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   5.3 M6P-abhängige Sortierung des Plbd2
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  5.4 Erzeugung von Plbd1- und Plbd2-defizienten Mausmodellen mittels CRISPR-Cas9
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   5.4.1 Etablierung von Guide-RNAs in Zellkultur
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   5.4.2 Erzeugung von knockout-Mausmodellen und Charakterisierung der Mutationen auf genomischer Ebene
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   5.4.3 Beurteilung der knockout-Mausmodelle auf Transkript- und Protein-Ebene
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   5.4.4 Untersuchung von phänotypischen Veränderungen
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   5.5 Potentielle Funktionen von Plbd1 und Plbd2
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   6 Ausblick
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   7 Literaturverzeichnis
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  Anhang
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   Genomische Sequenzen und Alignments
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   Plasmide
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   Sequenzierungen
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  Weitere Ergebnisse
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   Genotypisierung der Plbd2-KO-Tiere der F1-Generation
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   Validierung der knockout-Mausmodelle auf Transkript-Ebene
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   Western-Blots von Gewebehomogenaten aus Plbd2-HH- und Plbd2-mut-Tieren
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   Blutanalyse von WT-und Plbd1-KO-Mäusen
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   Abbildungsverzeichnis
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   Tabellenverzeichnis
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   Abkürzungsverzeichnis
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   Veröffentlichungen
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   Danksagung
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   Selbstständigkeitserklärung