Pseudoxanthoma elasticum (PXE) is a rare inheritable disorder that is characterized by extensive remodelling of the extracellular matrix (ECM). PXE is caused by mutations in the ABCC6 gene. By now, no conclusive pathophysiological connection between ABCC6 and the clinical findings of the disease could be established. Particularly, the molecular mechanisms leading to the ECM alterations are unknown. The clinical picture of PXE is highly variable, with age at disease onset and the number and magnitude of its symptoms differing considerably among patients. The individual disease phenotype is believed to be determined by environmental and genetic factors.

In order to identify genetic cofactors of PXE, 29 polymorphisms in four candidate genes, namely MMP2, MMP9, MMP14 and VEGFA, have been examined in this study. Comparison of allelic frequencies showed association of the polymorphisms c.-1575G>A, c.-1306C>T and c.-790T>G in the promoter of the MMP2 gene with PXE. Additionally, polymorphisms in the VEGFA gene could be shown to be associated with the retinopathy frequently accompanying PXE. Moreover, logistic regression analysis identified the c.-460T and the c.674C alleles of VEGFA as independent risk factors for the development of severe retinopathy.

An extensive analysis of the expression of ECM genes by dermal fibroblasts from PXE patients was performed and the data were compared with gene expression data of fibroblasts originating from healthy donors. The results showed significant alterations of the expression of several ECM genes as well as of genes connected to glycosaminoglycan (GAG) synthesis in PXE patients. Furthermore, a variation of the gene expression profile during prolonged in vitro cultivation could be demonstrated. Using siRNA mediated gene knockdown, ABCC6 deficiency was induced in normal dermal fibroblasts. In this model, gene expression variations that had been found in cells from PXE patients could be reproduced, thereby establishing a direct connection with lack of ABCC6 activity.

In another part of this work, [Delta]-disaccharides derived from GAGs produced by PXE fibroblasts were analyzed using a HPLC method and compared with the [Delta]-disaccharide composition of GAGs produced by normal dermal fibroblasts. The results showed an increased GAG synthesis by PXE fibroblasts which was accompanied by increased activity of xylosyltransferase, the initial enzyme in GAG biosynthesis. Both findings also occurred in normal dermal fibroblasts treated with siRNA against ABCC6. These findings point towards a direct interaction between ABCC6 deficiency and modified GAG synthesis.

Analysis of serum concentrations of matrix metalloproteinases in PXE patients and healthy control subjects showed significantly increased levels of MMP-2 and MMP-9 in the serum of PXE patients. For the first time, these results show an increased proteolytic potential in the serum of PXE patients, thereby corroborating the involvement of matrix metalloproteinases in PXE pathogenesis.

Finally, by transfection with a plasmid coding for the catalytic subunit of human telomerase, fibroblasts from PXE patients were immortalized and a PXE fibroblast cell line was established, which is ready to be used as a cell model for studying consequences of ABCC6 deficiency.

In summary, the results of the present work provide new insights into the mechanisms and genes involved in ECM remodelling, which is the hallmark of PXE.

Pseudoxanthoma elasticum (PXE) ist eine seltene vererbbare Erkrankung, die durch eine umfangreiche Umstrukturierung der extrazellulären Matrix (ECM) charakterisiert ist. Mutationen im ABCC6-Gen wurden als PXE-verursachend identifiziert. Ein eindeutiger pathophysiologischer Zusammenhang zwischen ABCC6 und den klinischen Symptomen der Krankheit konnte bis heute nicht hergestellt werden. Insbesondere ist unklar, welche molekularen Mechanismen zum beobachteten Umbau der ECM führen. Der Verlauf von PXE sowie die Schwere der Symptomatik sind sehr heterogen. Neben Umweltfaktoren beeinflussen auch genetische Kofaktoren das individuelle Krankheitsbild der Patienten.

Zur Identifizierung genetischer Kofaktoren wurden im Rahmen dieser Arbeit insgesamt 29 Polymorphismen in den vier Kandidatengenen MMP2, MMP9, MMP14 und VEGFA untersucht. Der Vergleich der Allelfrequenzen ergab eine signifikante Assoziation der Polymorphismen c.-1575G>A, c.-1306C>T und c.-790T>G im Promotor des MMP2-Gens mit PXE. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Polymorphismen im VEGFA-Gen mit dem Schweregrad der mit PXE regelmäßig einhergehenden Retinopathie assoziiert sind und dass die VEGFA-Allele c.-460T und c.674C unabhängige Risikofaktoren für einen schweren Verlauf der Retinopathie darstellen.

Um die Veränderung der ECM zu charakterisieren, wurde mittels realtime RT-PCR eine umfangreiche vergleichende Analyse der Genexpression dermaler Fibroblasten von PXE-Patienten und gesunden Spendern durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen signifikante Veränderungen der Expression bei PXE-Fibroblasten im Vergleich zu den Zellen gesunder Spender für eine Reihe von Genen, die ECM-Proteine codieren sowie für Gene, die an der Synthese von Glykosaminoglykanen (GAGs) beteiligt sind. Weiterhin konnte eine Veränderung des Genexpressionsmusters der PXE-Fibroblasten im Verlauf der Kultivierung nachgewiesen werden. Anhand einer in normalen Fibroblasten unter Verwendung von siRNA induzierten ABCC6-Defizienz konnten die gefundenen Expressions-Veränderungen im Wesentlichen reproduziert und somit in einen direkten Zusammenhang mit einem ABCC6-Mangel gestellt werden.

In einem weiteren Teil dieser Arbeit konnte durch eine Analyse der von GAGs abgeleiteten [Delta]-Disaccharide mittels einer HPLC-Methode eine verstärkte Synthese von GAGs durch PXE-Fibroblasten im Vergleich zu Zellen gesunder Spender demonstriert werden, die auch von einer erhöhten Aktivität der Xylosyltransferase, des initialen Enzyms der GAG-Biosynthese, begleitet wurde. Sowohl die veränderte GAG-Synthese als auch die Erhöhung der Xylosyltransferase-Aktivität bei PXE-Fibroblasten konnte in normalen dermalen Fibroblasten durch eine siRNA-induzierte ABCC6-Defizienz reproduziert werden. Damit gelang es, einen direkten Zusammenhang zwischen einem Mangel an ABCC6 und der bei PXE veränderten Synthese von GAGs herzustellen.

Im Rahmen der Suche nach Biomarkern für eine nichtinvasive Erfassung der Remodulierung der ECM bei PXE konnten in dieser Arbeit erstmals signifikant erhöhte Konzentrationen von MMP-2 und MMP-9 im Serum von PXE-Patienten nachgewiesen werden. Damit gelang es, die Hypothese einer Beteiligung von Matrix-Metalloproteinasen an der Degeneration von ECM-Strukturen bei PXE entscheidend zu untermauern.

Schließlich konnten durch Transfektion mit einem Telomerase-codierenden Plasmid primäre dermale Fibroblasten von PXE-Patienten immortalisiert und so eine PXE-Dermalfibroblasten-Zelllinie etabliert werden, die nun für Studien der Auswirkungen einer ABCC6-Defizienz zur Verfügung steht.

Die Ergebnisse dieser Arbeit gewähren neue Einsichten in die molekularen Mechanismen der ECM-Umstrukturierung, die das hervorstechende Merkmal von PXE ist, sowie in die genetischen Faktoren, die die Ausprägung des klinischen Phänotyps beeinflussen.