Titelaufnahme
Titelaufnahme
- TitelRekombinante Expression von humanen Xylosyltransferasen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris und in dem Bakterium Escherichia coli
- Verfasser
- Gutachter
- Erschienen
- SpracheDeutsch
- DokumenttypDissertation
- Schlagwörter
- URN
Zugriffsbeschränkung
- Das Dokument ist frei verfügbar
Links
- Social MediaShare
- Nachweis
- IIIF
Dateien
Klassifikation
Abstract
UDP-D-xylose: proteoglycan-core-protein [beta]-D-xylosyltransferase (EC 2.4.2.26, XylT) initiates the biosynthesis of glycosaminoglycan chains in proteoglycans by transferring xylose from UDP-xylose to specific serine residues of a core protein. Xylosyltransferase II (XylT-II) is a protein homologue to XylT-I, whose enzymatic activity was recently identified.
In this study, the putative catalytic domain of XylT-II was heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. It was produced as a soluble active protein and biochemically characterized. The substrate specificity for various acceptors was investigated and a modified bikunin peptide was shown to be the optimal XylT-II acceptor (K_M = 1.9 µM). The core protein/sugar-linkage type, the influence of nucleotide derivatives, the temperature optimum, the stability, the monofunctionality and the ion-dependency were investigated and among others the necessity for magnesium and manganese ions for the enzymatic activity was confirmed. An inhibition of XylT-II by its biosynthesis pathway end products in particular heparin was detected and an influence of basic proteins like histones and protamines was figured out.
The in-gel detection through purification of xylosyltransferase II was achieved from 40 liters P. pastoris-supernatant by a combination of ammonium sulphate precipitation, heparin affinity chromatography and ion exchange chromatography. With a final yield of 3 per cent, the protein was purified over 7000-fold compared to the original protein sample. The purified product was identified as XylT-II by mass spectra.
Further the heparin-binding sequence of xylosyltransferase II should be identified. Prerequisite for that was the production of a sufficient amount of purified protein. Because XylT-I binds independently of its structure to heparin, E. coli was chosen to produce soluble fusion proteins consisting of the solubility enhancement protein maltose-binding-protein (MBP) and XylT-II fragments. The fusion proteins were purified and the binding to heparin was analysed. Although the binding of various XylT-II fragments was immunologically detected, sufficient purified protein could not be produced for further analysis due to the fact that the codon usage of the human XylT-II mRNA was not optimized for proper E. coli processing.
Zusammenfassung
UDP-D-Xylose: Proteoglykan-Core-Protein [beta]-D-Xylosyltransferase (EC 2.4.2.16, XylT) initiiert die Biosynthese von Glykosaminoglykan-Seitenketten in Proteoglykanen durch den Transfer der Xylose von UDP-Xylose auf spezifische Serinreste eines Core-Proteins. Die Xylosyltransferase II (XylT-II) stellt ein XylT-I-paraloges Protein dar, dessen enzymatische Aktivität erst vor kurzem bestätigt werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die vermeintliche katalytische Domäne der XylT-II erstmals in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris heterolog als lösliches, funktionelles Protein produziert und biochemisch charakterisiert. Es wurde die Substratspezifität für diverse potentielle Akzeptoren untersucht und ein modifiziertes Bikunin-Peptid als optimaler XylT-II Akzeptor (K_M 1,9 µM) bestimmt. Die Core-Protein/Zucker-Konfiguration, der Einfluss von Nukleotid-Derivaten, das Temperaturoptimum, die Stabilität, die Monofunktionalität und die Ionenabhängigkeit wurden untersucht und dabei u.a. die Notwendigkeit für bivalente Mg^2+ - und Mn^2+ -Ionen für die enzymatische Aktivität ermittelt. Es wurde eine Inhibition der XylT-II durch Stoffwechselweg-Endprodukte, vornehmlich durch Heparin festgestellt und eine Einflussnahme basischer Proteine wie Histone und Protamine eruiert.
Die XylT-II konnte aus 40 Liter P. pastoris-Kulturüberstand durch eine Kombination von Ammoniumsulfat-Fällung, Heparin-Affinitätschromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie aufgereinigt werden. Bei einer Gesamtausbeute von 3 Prozent wurde hierbei über eine 7000fache Aufreinigung des Enzyms erreicht und das Produkt massenspektrometrisch als XylT-II identifiziert.
Als weiteres Projekt sollte die Heparin-bindende Aminosäuresequenz der XylT-II identifiziert werden. Voraussetzung dafür war die Herstellung einer ausreichenden Menge an gereinigtem Protein. Aufgrund der strukturunabhängigen Bindung von XylT-I an Heparin wurden in E. coli u.a. lösliche XylT-II-Fragmente als Fusionsproteine mit einem MBP-Affinitäts-Tag (Maltose-Binde-Protein) produziert, gereinigt und anschließend deren Heparin-Bindung analysiert. Dabei wurde immunologisch festgestellt, dass zwar eine Bindung verschiedener XylT-II-Fragmente vorhanden war, allerdings konnte wegen des nicht für E. coli optimierten Codon-Gebrauchs in der humanen XylT-II mRNA keine ausreichende Menge für die weiteren Analysen hergestellt werden.
Statistik
- Das PDF-Dokument wurde 5 mal heruntergeladen.