TY  - THES
AB  - Die Matrix Metalloproteinasen (Matrixine, MMPs) spielen sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Umstrukturierungen der extrazellulären Matrix eine wichtige Rolle. Ein Vertreter dieser Gruppe, die Makrophagenelastase (MMP-12), wird für den verstärkten Abbau des Elastinreichen Alveolargewebes beim Lungenemphysem verantwortlich gemacht. Mit dem Ziel einer eingehenden Charakterisierung, wurde die humane Makrophagenelastase rekombinant hergestellt. Die rekombinante Darstellung der katalytischen Domäne (KaDo) der humanen Makrophagenelastase mit und ohne Propeptid erfolgte ausgehend von der mRNA aus Chondrozytensarkomzellen und Plazentagewebe. Die jeweilige cDNA wurde kloniert und die rekombinanten Proteine in Escherichia coli exprimiert. Nach effizienter Reinigung an einer Affinitätsmatrix konnten somit zwei Varianten der KaDo der MMP-12 homogen isoliert werden: Die ohne Propeptid klonierte KaDo wurde mit einem N-terminalen Methioninrest (Met99-KaDo) erhalten. Im Gegensatz dazu wies die aus der ProKaDo generierte katalytische Domäne die Wildtyp-Form (Phe100-KaDo) auf.
Nach Spaltung eines synthetischen Mca-Peptids konnte mit Hilfe von MALDI-TOF-MS Messungen eine unterschiedliche Spezifität der KaDo der MMP-12 im Vergleich mit anderen MMPs festgestellt werden. Weiterhin konnte für die Phe100-KaDo eine ca. 10-fach höhere Aktivität verglichen mit der Met99-KaDo nachgewiesen werden. Für die drei der bisher vier bekannten "tissue inhibitors of metalloproteinases" (TIMPs) wurden in dieser Arbeit erstmals die Hemmkonstanten bestimmt. Die Ki-Werte lagen in Übereinstimmung mit Werten für die katalytische Domänen anderer MMPs im nanomolaren Bereich.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit waren in vitro Untersuchungen der Spaltung potentieller Substrate der humanen Makrophagenelastase. Myelin basic protein (MBP) und der Neurotransmitter Substanz P wurden in vitro degradiert, und es konnten bislang unbekannte Spaltstellen identifiziert werden. Weiterhin konnte die Degradierung von Faktor XII (Hagemann Faktor), Prothrombin und Fibrinogen gezeigt werden. Prothrombin wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal als Substrat einer Matrix Metalloproteinase untersucht. Die durch die MMP-12 generierten Fragmente zeigten proteolytische Aktivität gegenüber einem spezifischen Substrat für Thrombin.
Für den Aufbau eines ELISAs wurden polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen die katalytische Domäne der MMP-12 gewonnen. Mit Hilfe dieser Antikörper wurde im Folgenden erfolgreich ein kompetitiver ELISA aufgebaut.
Weiterhin wurden die Antikörper für immunhistochemische Untersuchungen eingesetzt. Dabei konnte die MMP-12 in Hautgeweben mit den Erkrankungen Ekzem, Lupus erythematodes und Dermatitis herpetiformis im Bereich des Stratum granulosum detektiert werden. Bei Hautgewebe mit dem Befund Lepra lepromatosa zeigte sich eine intensive Anfärbung der MMP-12 innerhalb infiltrierter Makrophagen. Weitere interessante Ergebnisse ergaben immunhistochemische Färbungen an Rückenmarkgewebe von wobbler Mäusen im Vergleich zu gesunden Tieren. In den von Neuronendegeneration betroffenen Bereichen bei der wobbler Maus konnte die Expression der MMP-12 in Mikrogliazellen gezeigt werden.
Durch Mutagenese-PCR wurde die für eine inaktive Variante kodierende cDNA amplifiziert. Die Inaktivierung wurde durch eine Punktmutation, bei der Glutamat 219 durch Alanin im katalytischen Zentrum ersetzt wurde, erreicht. Im Komplex mit Batimastat bildeten sich Kristalle, die mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse vermessen und nach Auswertung der Daten in ein Atommodell mit dreidimensionaler Struktur umgesetzt wurden. In einem Vergleich mit Strukturen anderer MMPs konnten Unterschiede identifiziert werden. Die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Kenntnisse über Aktivität, Vorkommen und Kristallstruktur der humanen Makrophagenelastase leisten somit einen entscheidenden Beitrag zur Charakterisierung dieser Matrix Metalloproteinase. Diese in vitro Ergebnisse können als Grundlage für weiterführende in vivo Untersuchungen dienen.
DA  - 2002
KW  - , Makrophagenelastase , Matrix Metalloproteinase , MMP-12 , TIMP (Tissue inhibitor of metalloproteinases) ,
LA  - ger
PY  - 2002
TI  - Darstellung und Charakterisierung der katalytischen Domäne der humanen Makrophagenelastase
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:361-2238
Y2  - 2024-11-24T00:11:28
ER  -