TY  - THES
AB  - Durch Isolierung der Gesamt-RNA aus den beiden humanen Ovarialkarzinomzelllinien OV-MZ-6 und OVCAR-3 und der humanen Mammakarzinomzelllinie MDA-MB-231 konnte mittels RT-PCR und Verwendung spezifischer Primer die für humanes ADAM 15 kodierende full length-DNA synthetisiert werden. Die anschließende DNA-Sequenzierung belegte erstmals die konstitutive Expression von hADAM 15 in diesen drei Tumorzelltypen. Durch Verwendung der full length-cDNA als PCR-Templat gelang die Klonierung verschiedener hADAM 15-cDNA-Fragmente, die nach Ligation in Expressionsvektoren, zur Transformation bzw. Transfektion von E. coli und P. pastoris bzw. den beiden Säugerzellen OV-MZ-6 und CHO eingesetzt wurden. Nach Etablierung der entsprechenden heterologen Expressionssysteme war die proteinchemische und zellbiologische Charakterisierung der Funktion von hADAM 15 möglich. Hierzu wurde nach Reinigung der in E. coli exprimierten Metalloproteinase-Domäne ein gegen diese Domäne gerichteter polyklonaler Antikörper hergestellt. Nach Reinigung des Antikörpers konnte dieser zur Detektion rekombinanter hADAM 15-Fragmente in der Western-Blot- und Kolonie-Blot-Analyse eingesetzt werden. Der Antikörper ermöglichte Aussagen über Expressionsraten, Prozessierung und Glykosylierung der rekombinaten hADAM 15-Fragmente. Die heterologe Expression potentiell proteolytisch aktiver und inaktiver Varianten von hADAM 15 in P. pastoris erbrachte erstmals Hinweise auf eine proteolytische Aktivität des Enzyms. Nur bei heterologer Expression der Proform der potentiell aktiven Metalloproteinase-Domäne von hADAM 15 wurde die Aktivität einer konstitutiv exprimierten P. pastoris-Proteinase unterdrückt. Die Expression der entsprechend potentiell inaktiven Mutante der Proform der Metalloproteinase-Domäne beeinflusste die Aktivität dieser P. pastoris-Proteinase nicht. Zusätzlich zur Metalloproteinase-Domäne wurde in dieser Arbeit die Disintegrin-Domäne von hADAM 15 untersucht, die als einzige der bisher bekannten ADAMs ein RGD-Motiv enthält. Hierbei interessierte insbesondere die integrinantagonistische Wirkung von hADAM 15 in der humanen Ovarialkarzinomzelllinie OV-MZ-6. Eine Überexpression von hADAM 15 führte in dieser Zelllinie zu einer signifikanten Unterdrückung der Adhäsion auf Vitronektin. Diese antiadhäsive Wirkung könnte auf eine Beteiligung von hADAM 15 bei der Disseminierung von Zellen in andere Gewebe hindeuten. Möglicherweise könnten die antiadhäsiven Eigenschaften von hADAM 15 - in Analogie zu anderen RGD-Disintegrinen - auch zur Induktion apoptotischer Vorgänge führen.
DA  - 2001
KW  - Metalloproteinasen , Membranproteine , Disintegrin , Heterologe Genexpression , Struktur-Aktivitäts-Beziehung , Metalloproteinase , Disintegrin , ADAM 15 , Integrin ,
LA  - ger
PY  - 2001
TI  - Klonierung, Expression und Charakterisierung der Metalloproteinase-Domäne und Disintegrin-Domäne von humanem ADAM 15
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:361-4666
Y2  - 2024-11-21T22:40:43
ER  -