TY  - THES
AB  - Exportierte bakterielle Proteine können aufgrund ihrer extrazellulären Lokalisation eine wichtige Rolle in der Entwicklung einer Bakterien-­‐Pflanzen-­‐Interaktion übernehmen. Um die potentiellen Faktoren, die an der Interaktion zwischen dem phytopathogenen Bakterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis und seiner
Wirtspflanze Tomate beteiligt sind, zu identifizieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels 2D-­‐Gelelektrophorese und MALDI-­‐TOF-­‐MS umfangreiche Exoproteomanalysen der ins Aussenmedium sekretierten Proteine (dem Exoproteom) von Cmm durchgeführt. Unter
allen untersuchten Bedingungen wurden insgesamt 150 verschiedene Proteine identifiziert. Die Analyse der
Aminosäuresequenzen dieser Proteine mit Hilfe verschiedener
computergestützter Vorhersageprogramme, zeigte bei 52%
(78 Proteine) die Präsenz eines Signalpeptides. Die restlichen 48% (73 Proteine) besitzen kein Signalpeptid, es
handelt sich um intrazelluläre Proteine, die entweder über
Zelllyse oder über noch unbekannte Sekretionsmechanismen
nach außen gelangten. Die Analyse des Exoproteoms von Cmm
in M9-­‐Minimalmedium, das Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, führte zur Identifizierung
zahlreicher extrazellulärer Proteine, unter denen sich mehrere bereits bekannte Virulenzfaktoren (CelA, Pat-­‐1,
PpaC, ChpC), aber auch vermutete Virulenzfaktoren (Ppa-­‐Familie: PpaB1/B2, C, D, E, F, G, H, I, J; Chp-­‐Familie:
ChpE; Subtilasen-­‐Familie: SbtB, C) befinden, die alle in
hohen Mengen sekretiert wurden und für die eine Beteiligung
an der Phytopathogenität des Bakteriums angenommen wird.
Von den extrazellulären Enzymen, die pflanzliche Zellwandpolymere abbauen können, konnten neben der Cellulase (CelA), eine Xylanase (XysA), die Polygalakturonase (PgaA) und eine der beiden putativen
Endoglukanasen (EndY) nachgewiesen werden. Bei mehreren
Proteinen (CelA, SbtC, mehrere Ppa-­‐Serinpeptidasen) wurden
aufgrund der teilweise starken Abweichung der tatsächlichen
von den vorhergesagten Werten für den isoelektrischen Punkt
und/oder Molekulargewicht, Anzeichen für eine Prozessierung
gefunden. Die vergleichenden Analysen der Exoproteome von
Cmm in verschiedenen Medien führten zu dem Ergebnis, dass
die Supplementierung des M9-­‐Minimalmediums mit Xylemsaft/Tomatenblatthomogenat aus nicht infizierten Pflanzen zur Induktion von extrazellulären für die pathogene Interaktion relevanten Proteinen nicht benötigt
wird.
Auch
die
Zugabe
von
Zuckerpolymeren,
die
Bestandteile
der
pflanzlichen
Zellwand
darstellen,
hatte
keinen
induzierenden
Effekt
auf
die
Synthese
dieser
Zuckerpolymere-­‐abbauenden
Enzyme.
Die
vergleichenden
Exoproteomanalysen
in
M9-­‐Minimalmedium
und
Vollmedium
zeigten
dagegen,
dass
die
in
M9-­‐Minimalmedium
hoch
induzierten
Virulenzfaktoren
in
Vollmedium
reprimiert
sind
und
die
Zugabe
von
Glukose
weder
Induktion
noch
Repression
dieser
Virulenzfaktoren
hervorruft.Um
die
Rolle
der
Zellwandpolymere-­‐abbauenden
Enzyme
in
der
Virulenz
zu
überprüfen,
wurden
in
den
zwei
Xylanasen
(XysA,
XysB),
eine
Polygalakturonase
(PgaA),
eine
Cellulase
(CelB)
und
zwei
Endoglukanasen
(EndX,
EndY)
kodierenden
Genen
„Knock
out“-­‐Mutanten
hergestellt.
Mit
Ausnahme
der
endX-­‐
und
endXY-­‐Mutanten,
die
zu
einem
verzögerten
Auftreten
der
Welke
führten,
hatte
keine
dieser
Mutanten
Auswirkung
auf
die
Pathogenität.
Zuletzt
konnte
für
beide
Xylanasen
(XysA
und
XysB)
über
Agarplattentests
und
Zymogramme
eine
Xylanaseaktivität
nachgewiesen
werden.
Die
Sec-­‐
und
Tat-­‐Systeme
wurden
in
Cmm
als
zwei
generelle
Proteintransportsysteme
identifiziert,
die
eine
Signalpeptid-­‐abhängige
Sekretion
extrazellulärer
Proteine
in
die
Umgebung
der
Zelle
vermitteln.
Um
die
Rolle
dieser
Systeme
für
die
Proteinsekretion
allgemein
und
für
die
Sekretion
von
Virulenzfaktoren
zu
bestimmen,
wurden
das
secG-­‐Gen
und
das
tatB-­‐Gen
durch
die
Insertion
einer
Antibiotikaresistenzkassette
inaktiviert.
Beide
Gene
kodieren
Komponenten,
die
am
Aufbau
der
Translokationspore
beteiligt
sind.
Die
Inaktivierung
des
secG-­‐Gens
und
auch
des
tatB-­‐Gens
hatte
einen
Wachstumsdefekt
der
Mutanten
auf
Minimal-­‐
und
Vollmedium
zur
Folge.
Der
Vergleich
der
Exoproteome
der
Sekretionsmutanten
und
des
Wildtyps
NCPPB382
ergab,
dass
die
Mutation
des
secG-­‐Gens
zu
einer
reduzierten
Sekretionsrate
mehrerer
Proteine
führte,
während
die
Zusammensetzung
des
Exoproteoms
unverändert
blieb.
Im
Gegensatz
dazu
bewirkte
die
Mutation
des
tatB-­‐
Gens
eine
vollständige
Blockade
in
der
Sekretion
von
zwei
Proteinen
(NagA
und
CMM_0338).
Folglich
scheint
die
SecG-­‐Komponente
für
die
Funktionalität
der
Sec-­‐
Translokase
nicht
essentiell
zu
sein,
aber
deren
Effizienz
zu
erhöhen.
Das
TatB-­‐Protein
stellt
dagegen
eine
essentielle
Komponente
der
Tat-­‐Translokase
dar.
In
planta
zeigten
beide
Mutanten
einen
avirulenten
Phänotyp,
sie
waren
nicht
mehr
in
der
Lage,
die
Pflanzen
erfolgreich
zu
kolonisieren
und
Krankheitssymptome
auszulösen.
Allerdings
lässt
sich
die
Avirulenz
der
Sekretionsmutanten
nicht
durch
die
beobachteten
Veränderungen
des
Exoproteoms
erklären,
so
dass
in
Zukunft
das
Membran-­‐
und
das
Zellwandproteom
untersucht
werden
sollten,
um
weitere
über
die
Sec-­‐/Tat-­‐Systeme
translozierte
Proteine
zu
identifizieren,
die
Zellhüllen-­‐gebunden
sind,
aber
für
die
Virulenz
wichtige
Funktionen
besitzen
könnten.
DA  - 2012
KW  - Exoproteom
KW  - 2D-Gelektrophorese
KW  - Sec- und Tat-Sekretionssysteme
LA  - ger
PY  - 2012
TI  - Das Exoproteom von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis und Untersuchung von Mutanten im Sec- und Tat-Sekretionssystem
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:361-25103569
Y2  - 2024-11-22T04:56:08
ER  -