TY  - THES
AB  - Zusammenfassung
In vorausgegangenen Arbeiten über das Verhalten temperaturresistenter (tr) und
temperatursensitiver (ts) Tabakmosaikvirus-Hüllproteine (TMV-HP) im Pflanzengewebe war
gezeigt worden, dass denaturierte, unlösliche Hüllproteine zu einer deutlichen Ubiquitin-
Reaktion im Sediment der Extrakte infizierter Pflanzen führen. Die Verschiebung des
isoelektrischen Punktes der Ubiquitin-positiven Proteine bei der Verwendung von TMV-HPMutanten
mit Ladungsaustauschen zeigte, dass das Hüllprotein das hauptsächliche Ziel der
Ubiquitinierung ist (Jockusch, H., Wiegand, C., FEBS Lett.;545:229-232,2003).
In der folgenden Arbeit wurde untersucht, wie tierische Zellen auf fehlgefaltetes TMV-HP
reagieren. Dazu wurden die cDNAs tr und ts Mutanten des TMV-HP in einem
Expressionsvektor transient in Säugerzellen (Neuro2a und Cos7) transfiziert und die
Zustandsformen der TMV-HPs und die Reaktion der Zelle darauf untersucht. Die Bedeutung
der Prolinreste (P) im TMV-HP für seine Stabilität wurde durch den Austausch von P gegen
Leucin (PnL) an den acht möglichen Positionen (n) analysiert. Zur Steigerung der Sensitivität
des HP-Nachweises wurde an dessen C-Terminus eine zehn Aminosäuren lange
Markierungssequenz aus Birkenpollenprofilin angehängt, die mit einem monoklonalen
Antikörper nachgewiesen wurde (Rüdiger, M., et al., Biotechniques 23, 96-7 (1997).
Diffus in der Säugerzelle verteiltes, freies ts TMV-HP aggregiert nach Erhöhung der
Inkubationstemperatur innerhalb von wenigen Stunden. Die Aggregate enthalten das
Hitzeschockprotein HSP70 und zeigen eine positive Ubiquitin-Reaktion. Das
Temperaturverhalten von Wildtyp und ts HPs in der tierischen Zelle ist ähnlich wie in der
Pflanzenzelle. Die Denaturierungstemperatur liegt aber in der tierischen Zelle in einigen
Fällen höher als im pflanzlichen Gewebe.
Die Anzahl HP-positiver Zellen steigt nach der Transfektion bei einer Inkubationstemperatur
von 30 °C im Lauf von 48 Stunden an. Bei 37 °C ist die Zahl der TMV-HP positiven Zellen
wesentlich geringer, die Zahl aktivierter Caspase 3 (cCasp3) positiver und HP positiver Zellen
höher als bei 30 °C, was auf einen pathogenen Einfluss der Fremdproteine schließen lässt.
Die durch Immunblot gemessene Konzentration cCasp3 in Säugerzellextrakten war in mit
HP-cDNA transfizierten Zellen im Vergleich zu mit GFP transfizierten oder nicht
transfizierten Zellen erhöht. Lysin-freie HP einiger Mutanten und des Wildtyps vulgare
aggregieren mehr oder weniger stark. Zusammen mit diesen Aggregaten wurde eine etwas
schwäche Ubiquitin-Kolokalisation als bei den entsprechenden Lysin-haltigen HP beobachtet.
Wurde der Proteasominhibitors MG132 dem Transfektionsansatz zwei Tage nach der
Transfektion zugesetzt, stieg die Zahl der HP- und GFP-produzierenden Zellen stärker an als
im Kontrollansatz ohne Inhibitor. Die Inhibierung der Proteasome führt in den Zellen, die
lösliches HP oder GFP produzieren zu einer stärkeren Apoptose als in den Zellen, in denen
das TMV-HP aggregiert war.
Die Untersuchungen an TMV-HP-transfizierten Säugerzellen ergaben:
- Im Pflanzengewebe temperatursensitive HPs sind auch in Säugerzellen ts.
- Aggregate aus ts TMV-HP sind positiv für Ubiquitin, auch wenn das HP kein Lysin enthält.
Demnach scheinen ubiquitinierte zelluläre Proteine mit dem TMV-HP zu koaggregieren.
- Die Konzentration der cCasp.3 steigt in den mit TMV-HP-cDNA transfizierten Zellen an,
die Anhäufung des Fremdproteins induziert apoptotische Prozess.
DA  - 2008
KW  - Tabakmosaikvirus-Hüllproteine
KW  - Temperaturverhalten von TMV - Hüllprotein
KW  - Ubiquitin
LA  - ger
PY  - 2008
TI  - Pathologie und Pathogenität eines viralen Strukturproteins : Faltung und pathogene Effekte von mutierten TMV -Hüllproteinen in pflanzlichen und tierischen Zellen
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:361-25541111
Y2  - 2024-11-21T21:56:57
ER  -