TY  - THES
AB  - Endotheline sind vasoaktive Peptidhormone, die über die Stimulation der beiden
G-Protein-gekoppelten Endothelin-Rezeptor-Subtypen A und B die Aktivierung der
Phospholipase C (PLC) und somit einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration
induzieren. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (G protein coupled receptors, GPCRs)
unterliegen einer fein abgestimmten Regulation, um einer Überstimulation der Zelle
vorzubeugen. Der klassische Desensibilisierungsmechanismus beinhaltet die Phosphorylierung
des aktivierten Rezeptors durch GPCR-Kinasen (GRKs). Eine Phosphorylierung
durch diese Serin/Threonin-Kinasen erhöht die Affinität des Rezeptors zu Arrestin,
welches daraufhin bindet und zu einer sterischen Blockade und somit zur Entkopplung
des Rezeptors vom G-Protein führt. Die Rezeptor-Phosphorylierung spielt für viele GPCRs
ebenfalls eine Rolle in der Agonisten-induzierten Rezeptor-Endozytose (Internalisierung).
Im Endothelin A (ETA)-Rezeptor sind 15 Phosphorylierungsstellen (13 hiervon
Serin/Threonin-Reste) bekannt, die sich hauptsächlich in der Sequenz, die der
C-terminalen Palmitoylierungsstelle folgt, befinden. Diese Sequenz (im Folgenden als
C-terminale Extremität (CTE) bezeichnet) enthält drei Serin- und sieben Threonin-Reste.
Sechs dieser zehn Phosphorylierungsstellen befinden sich in einem proximalen, vier in
einem distalen Cluster.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Desensibilisierung des ETA-Rezeptors untersucht. Ob
die GRK2, deren Beteiligung an diesem Prozess bekannt ist, hier die Funktion einer Kinase
einnimmt und welche Phosphorylierungsstellen gegebenenfalls involviert sind, ist nicht
eindeutig geklärt. Daher wurden durch den Austausch von Serin und Threonin gegen
Alanin phosphorylierungsdefiziente ETA-Rezeptoren hergestellt und in der Zelllinie
HEK 293 transient exprimiert. Während kontinuierlicher Endothelin-1 (ET-1)-Stimulation
wurde die PLC-Aktivität analysiert, um Aufschluss über die Regulation der phosphorylierungsdefizienten
ETA-Rezeptor-Mutanten zu erhalten.
Die kombinierte Substitution der in der CTE befindlichen Serin/Threonin-Reste, jedoch
nicht die Substitution aller proximalen oder aller distalen Phosphorylierungsstellen, führte
zu einer gestörten Desensibilisierung, was sich in einer Erhöhung des PLC-Signals unter
kontinuierlicher ET-1-Stimulation manifestierte. Für eine physiologische Desensibilisierung
schien das Vorhandensein mindestens eines intakten Serin/Threonin-Clusters
obligatorisch zu sein, denn die PLC-Aktivität jeder untersuchten Mutante mit einer
Kombination aus proximalen und distalen Substitutionen war gegenüber der PLC-Aktivität
des Wildtyps signifikant erhöht.
Des Weiteren wurde die ET-1-induzierte PLC-Aktivität von Zellen untersucht, die den
ETA-Rezeptor und GRK2 transient koexprimierten. Neben der wildtypischen Kinase
(GRK2-WT) kamen die beiden Mutanten GRK2-D110A und GRK2-D110A/K220R zum
Einsatz. Die Mutation K220R wurde gewählt, da sie in einer katalytisch inaktiven GRK2
resultiert. Die Mutation D110A beeinträchtigt hingegen die Bindung von GRK2 an Gαq. Die
rekombinante Expression von GRK2-WT führte sowohl beim wildtypischen ETA-Rezeptor
(ETA-WT) als auch bei der phosphorylierungsdefizienten Mutante ETA-6PD (mit einer
Kombination aus proximalen und distalen Substitutionen) zu einer Reduktion der
PLC-Aktivität. Durch eine Expression von GRK2-D110A wurde die ETA-WT-, jedoch nicht
die ETA-6PD-vermittelte PLC-Aktivität inhibiert. Beide Signale waren von einer GRK2-
D110A/K220R-Expression unbeeinträchtigt. Diese Ergebnisse belegen, dass in die
Desensibilisierung des ETA-Rezeptors mindestens zwei unabhängige GRK2-vermittelte
Komponenten involviert sind: 1) ein phosphorylierungsunabhängiger Mechanismus, der
durch die Bindung der Kinase an Gαq realisiert wird und 2) ein Mechanismus, der die
Phosphorylierung von Serin/Threonin-Resten in der CTE des Rezeptors beinhaltet und in
redundanter Weise in der Lage ist, entweder proximale oder distale Phosphorylierungsstellen
zu involvieren. Das Vorhandensein eines phosphorylierungsabhängigen Desensibilisierungsmechanismus
konnte durch GRK2-Knockdown-Experimente bestätigt werden.
In HEK 293-Zellen wurde zusätzlich die Internalisierung von ETA-WT und einer Mutante,
bei der alle bekannten Serin- und Threonin-Phosphorylierungsstellen entfernt wurden,
untersucht. Hierfür wurden die auf der Zelloberfläche exprimierten Rezeptoren mit HiLyte
Fluor 488-gekoppeltem ET-1 markiert. Die Internalisierung der fluoreszenzmarkierten
Rezeptoren wurde im konfokalen Laser Scanning-Mikroskop beobachtet. Es wurden keine
Unterschiede in der Endozytosegeschwindigkeit des wildtypischen und des phosphorylierungsdefizienten
Rezeptors festgestellt. Dies lässt den Schluss zu, dass die
Internalisierung des ETA-Rezeptors phosphorylierungsunabhängig geschieht.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten auf eine komplexe ETA-Rezeptor-
Regulation hin. Die gleichzeitige Beteiligung von phosphorylierungsabhängigen
und -unabhängigen Komponenten an der Desensibilisierung und Internalisierung geht
über das klassische Paradigma der GPCR-Regulation hinaus und könnte im Zusammenhang
mit einer Zelltyp-spezifischen Feinabstimmung des Endothelin-Signals stehen.
DA  - 2014
KW  - Internalisierung
KW  - Endothelin Rezeptor A
KW  - Desensibilisierung
KW  - GPCR
LA  - ger
PY  - 2014
TI  - Desensibilisierung und Internalisierung des Endothelin A-Rezeptors: Rolle der Rezeptor-Phosphorylierung
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:361-26758034
Y2  - 2024-11-22T05:36:16
ER  -