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Dlugos, Christopher Philipp Gerhard: Der Septin-assoziierte RhoGEF : Ein neuer Interaktionspartner des Zellpolaritäts- und Gerüstproteins PATJ. 2011
Inhalt
1 Einleitung
1.1 Bau und Funktion der Niere
1.2 Podozyten und Schlitzmembran
1.3 Zellpolarität
1.4 Das Zellpolaritäts- und Gerüstprotein PATJ
1.5 Die Rho-GTPasen
1.6 Zielstellung
2 Material
2.1 Geräte
2.2 Allgemeine Chemikalien
2.3 Lösungen und Puffer
2.4 Verbrauchsmaterialien und Kits
2.5 Kulturmedien
2.5.1 Medien zur Kultivierung von Hefen
YPAD-Medium/Agarplatten
SD-Selektionsmedium/Agarplatten
SD-L-T entspricht Hefeagarplatten ohne Leucin und Tryptophan. Analog dazu enthalten SD-L-T-H kein Leucin, kein Tryptophan und kein Histidin.
3-AT-Lösung
2.5.3 Medien zur Kultivierung eukaryoter Zellen
2.6 Bakterien (Escherichia coli)
2.7 Hefen (Saccharomyces cerevisiae)
2.8 Zelllinien
2.9 Enzyme
2.10 Antikörper
2.11 Plasmide und Vektoren
2.12 Oligonukleotide
3 Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)
3.1.2 Restriktionsanalyse
3.1.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
3.1.4 Agarosegelelektrophorese
3.1.5 Purifikation von DNA-Fragmenten
3.1.6 Klonierung
3.1.7 Plasmidpräparation
3.2 Proteinbiochemische Methoden
3.2.1 Herstellung des rekombinanten GST-Fusionsproteins (GST-PDZ 2)
3.2.2 Proteinbestimmung
3.2.3 Durchführung der GST-Pulldowns
3.2.4 Proteinexpression und Proteinextraktion im eukaryoten System
3.2.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)
3.2.6 Western Blot
3.2.7 Coomassie-Färbung von PVDF-Membranen
3.2.8 Co-Immunopräzipitation von EYFP-PATJ/FLAG-SA-RhoGEF fl
3.3 Zellbiologische und mikrobiologische Methoden
3.3.1 Kultivierung und Lagerung von Hefen (Saccharomyces cerevisiae)
3.3.2 Kultivierung und Lagerung von Bakterien (Escherichia coli)
3.3.3 Kultivierung eukaryoter Zellen (HEK 293T)
3.3.4 Einfrieren eukaryoter Zellen
3.3.5 Auftauen eukaryoter Zellen
3.3.6 Transformation von Bakterien
3.3.7 Transiente Transfektion von HEK 293T-Zellen
3.4 Das Yeast Two-Hybrid System
3.4.1 Herstellung kompetenter Hefezellen
3.4.2 Transformation von Hefezellen
3.4.3 Prey Plasmid-DNA-Isolation
3.4.4 β-Galactosidase Filter Assay (β-Gal-Assay)
3.5 Immunhistochemische Analyse
4 Ergebnisse
4.3 Mapping der PATJ-SA-RhoGEF Interaktionsdomänen
4.3.1 Mapping der PATJ -Interaktionsdomäne
4.3.2 Mapping der SA-RhoGEF-Bindungsdomäne
4.4 Expression von SA-RhoGEF in der Niere
4.4.1 Expressionsanalyse von SA-RhoGEF mittels Western Blot
4.4.2 Immunhistochemischer Expressionsnachweis
5 Diskussion
5.1 SA-RhoGEF - ein neuer Interaktionspartner von PATJ
5.2 SA-RhoGEF - ein wichtiges Mitglied innerhalb des PATJ-Polaritätsnetzwerks
5.3 Die Rolle von SA-RhoGEF in Podozyten
5.4 Der Septin- assoziierte RhoGEF
5.5 SA-RhoGEF - ein Schnittstellenprotein aufgrund multipler
Proteinbindungsdomänen
6 Ausblick
7 Bibliographie
Danksagung