Wobser, Marion: Evaluation eines retroviralen Transfektionssystems zur Hemmung der Telomerase mittels DN-hTERT in Neuroblastomzellen. 2006
Inhalt
- Inhaltsverzeichnis
- 2 MATERIAL UND METHODEN……………………………….………11
- 2_DissertationHauptteil.pdf
- 1 Einleitung
- Abb. 4: Modell zur schrittweise Entartung einer normalen, somatischen Zelle begrenzter Proliferationskapazität zur immortalen, maligne transformierten Tumorzelle.
- 2 Material und Methoden
- 2.1.2 Anzucht der Bakterien
- EcoRI
- EcoRI
- 2.2.2 DNA-Prüfgel
- 2.2.5 DNA-Gel
- 2.2.6 Transfer
- 2.2.7 Hybridisierung
- 2.2.8 Detektion
- 2.4 Transfektion
- RPMI
- Total
- 2.4.2 Infektion der Zielzellen
- 2.6.1 Zelllinien
- 2.5.2 Materialien
- 2.11.3 Passagieren der Zellen
- 2.11.4 Einfrieren der Zellen
- 2.11.5 Auftauen der Zellen
- 2.11.6 Antibiotika-Selektionierung
- EcoRI
- HindIII
- EcoRI/HindIII
- EcoRI
- SalI
- EcoRI/SalI
- Legende: 1: pBabe-WT-hTERT-Plasmid nach Verdau mit EcoRI/SalI, 2: pBabe-WT-hTERT-Plasmid nach Verdau mit SalI, 3: pBabe-WT-hTERT-Plasmid nach Verdau mit EcoRI, Längenstandard, 4: Unverdaute pBabe-WT-hTERT-Plasmid-DNA, 5: Längenstandard
- Abb. 16: Nach Sequenzierung des WT-hTERT-Plasmids mit dem Primer 107/01 stellt sich nach Auswertung mit Blast2 Sequence die Mutationsstelle mit der Wildtypsequenz 5´-GTGGATGTG-3´ in (3560–3568 bp) dar.
- WT-hTERT
- DN-hTERT
- Lokalisation
- Basensequenz
- Aminosäuresequenz
- Abb. 28: Die gelelektrophoretische Auftrennung der DNA weist das amplifizierte Puromycinresistenzgen in der mit dem pBabe-Leervektor und pBabe-WT-hTERT-Vektor transfizierten Zelllinie SKNSH nach. Im Bereich von ca. 200 bp zeigt sich die DNA-Bande. Als Positivkontrolle wurden die Plasmide pBabe/pBabe-WT-hTERT/pBabe-DN-hTERT in die PCR eingesetzt. Der Versuch wurde 2 mal während eines Kultivierungszeitraums von 1 Monat mit entsprechenden Ergebnissen wiederholt.
- Legende: 1: Positivkontrolle (Plasmid pBabe-DN-hTERT), 2, 3: SKNSH pBabe-WT-hTERT, 4: Längenstandard, 5: Negativkontrolle (Ladepuffer), 6, 7: SKNSH pBabe-Leervektor
- Abb. 29: Das Amplifikationsprodukt läßt sich nur in den mit DN-hTERT transfizierten SKNSH-Zellen nachweisen, nicht jedoch in den untransfizierten Zellen. Eine Versuchswiederholung lieferte gleiche Ergebnisse.
- Legende: 1: Positivkontrolle (Plasmid pBabe-DN-hTERT), 2: Negativkontrolle (Ladepuffer), 3, 4: SKNSH pBabe-DN-hTERT, 5: Längenstandard, 6: Positivkontrolle (pBabe-Leervektor), 7, 8: untransfizierte SKNSH, 9: Negativkontrolle (Ladepuffer)
- 3.4.4 Telomerenlängenbestimmung
- 3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse zur Evaluation
- 4.3.1 Nebenwirkungen einer Telomeraseinhibition