Robert, Stella R. ; Robert, Stella Ramanantenasoa: Untersuchung zu ubiquitär und nicht ubiquitär exprimierten Antigenen bei Alloantigen-vermittelter T-zellulärer Reaktion nach allogener Stammzelltransp [...]. 2014
Inhalt
- Zusammenfassung
- Abstract
- 1. Einleitung
- Das Immunsystem und das blutbildende System
- Maligne Erkrankungen
- Entwicklung einer Immuntoleranz
- Stammzelltransplantation
- Zelluläre Immunreaktionen nach allogener SZT
- i. Host-versus-Graft-Disease (HvGD)
- ii. Graft-versus-Host-Disease (GvHD)
- iii. Graft-versus-Leukemia/Tumor (GvL/GvT)
- Molekulare Grundlagen des Immunsystems
- i. Major Histocompatibility Complex (MHC)
- ii. Minor Histocompatibility Antigen (mHag)
- iii. Das männliche minor Histokompatibilitätsantigen „HY“
- iv. Tumorantigene (engl. Tumor Antibody Generating)
- Das murine Parent-into-F1-Generation-Transplantationsmodell
- Ziel der vorliegenden Arbeit
- 2. Ergebnisse
- 2.1 Etablierung einer Leukämiezelllinie mit einer stabilen HY-Expression
- 2.1.1 Retrovirale Transduktion mit Hilfe des Gateway Cloning Systems
- 2.1.2 Nachweis des UTY-Gens
- 2.1.3 HY-Expression
- 2.1.4 In vivo-Passagierung der Tumorzelllinien
- 2.2 C1498-GFP-UTY in vivo
- 2.2.1 Immunogenität des exprimierten Alloantigens HY
- 2.2.2 Tumorwachstumskinetik in Abhängigkeit der Zellzahl
- 2.2.3 Tumorwachstumskinetik in Abhängigkeit der Inokulationszeit
- 2.3 Allogene Stammzelltransplantation
- 2.3.1 Konditionierungtherapie
- 2.3.2 GvHD-Entwicklung in Abhängigkeit der Lymphozyten-Zellzahl und des Spenders
- 2.3.3 Modulation der GvHD- und der GvT-Reaktion in Abhängigkeit der transferierten Lymphozyten-Zellzahl
- 2.3.4 Chimärismus-Analyse
- 2.3.5 Das männliche mHag HY ist ein GvHD-Target
- 2.3.6 Höhere Mortalitätsrate bei einer HY mHags-Disparität
- 2.4 Einfluss des mHags HY auf den GvT-Effekt nach SZT
- 2.4.1 C1498-GFP-UTY-Wachstumskinetik in Abhängigkeit des HY-Expressionsmusters (in ♀ vs. ♂ CB6F1-Empfängern)
- 2.4.2 HY wird tumorspezifisch exprimiert (TAA) in ♀ CB6F1-Empfängern
- 2.4.3 HY wird ubiquitär exprimiert in ♂ CB6F1-Empfängern
- 2.4.4 Kontrolltransplantation mit männlichem Transplantat (HY-kompatibel)
- 2.5 Differenzierte Zytokin-Sekretion der allogen transplantierten Gruppen
- 2.5.1 IFN-γ-Expression als anti-HY-spezifische T-Zellaktivität
- 2.5.2 Zytokin-Sekretion der allogen transplantierten Empfängertiere
- 2.6 In vitro-Charakterisierung der Effektorzellen
- 2.6.1 Identifizierung spezifischer anti-HY-CD8+-T-Zellen
- 2.6.2 In vivo-Imaging und Infiltration des C1498-GFP-UTY-Tumors
- 2.6.3 Etablierung vonT-Zell-Rezeptor(TCR)-Profilen (Spectratyping)
- 3 Diskussion
- 4 Fazit und Ausblick
- 5 Material und Methoden
- 5.1 Zellkultur
- 5.1.1 Kultivierung muriner Tumorzelllinien
- 5.1.2 Murine Tumorzelllinien
- 5.1.3 Bestimmung der Zellzahl in einer Neubauer-Zählkammer
- 5.2 Molekularbiologische Methoden
- 5.2.1 RNA-Isolierung
- 5.2.2 cDNA-Synthese: Reverse Transkription
- 5.2.3 DNA-Isolierung
- 5.2.4 Photometrische Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration
- 5.2.5 Geschlechtsbestimmung mit der Standard-PCR
- 5.2.6 Nachweis des Ziel-Gens UTY
- 5.2.7 Agarose-Gelelektrophorese
- 5.2.8 Oligonukleotidprimer
- 5.2.9 Primer für die Standard-PCR
- 5.2.10 Primer für die Sequenzierung
- 5.2.11 Primer für die Real-time-quantitative PCR (qPCR)
- 5.2.12 Primer für die Spectratyping-/Immunoscope-Analyse
- 5.2.13 Real-time-quantitative PCR (qPCR)
- 5.2.14 Stabile Transfektion/Gateway Cloning System
- 5.3 Proteinbiochemie
- 5.4 In vitro-Generierung von T-Zellklonen gegen das HY-Antigen
- 5.4.1 Bestrahlung der Targetzellen
- 5.4.2 Primäre mixed tumor lymphocyte culture (MTLC)
- 5.4.3 Sekundäre mixed tumor lymphocyte culture (MTLC)
- 5.4.4 Subklonieren der HY-spezifischen T-Zellen
- 5.4.5 Screening der positiven T-Zellen
- 5.4.6 Kultivierung der positiven T-Zellklone
- 5.5 T-Zell-Rezeptor(TCR)-Profil (Spectratyping)
- 5.6 Enzyme Linked Immuno Spot Assay (IFN-γ-ELISpot)
- 5.7 Durchflusszytometrie (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS)
- 5.8 Cytometric Bead Array-Analyse (CBA)
- 5.9 Histologie
- 5.10 Tierexperimentelle Methoden
- 5.10.1 Murines Transplantationsmodell
- 5.10.2 Narkotisieren der Mäuse
- 5.10.3 Stammzellgewinnung
- 5.10.4 Isolierung von Splenozyten (Milzzellen)
- 5.10.5 Gewinnung von Knochenmarkzellen
- 5.10.6 Separation von Zellpopulationen
- 5.10.7 Immunisierung der Spendertiere
- 5.10.8 Konditionierung/Bestrahlung der Empfängertiere
- 5.10.9 Stammzelltransplantation
- 5.10.10 Tumorapplikation
- 5.10.11 GvHD-Monitoring
- 5.10.12 Tumorkinetik
- 5.10.13 Fluorescence reflectance imaging (FRI)
- 5.11 Statistisches Auswertungsverfahren
- 5.11.1 Bestimmung der Standardabweichung (SD) und des Standardfehlers (SEM)
- 5.11.2 Bestimmung der Signifikanz
- 6 Anhang
- 6.1 UTY-Gensequenz
- 6.2 Abkürzungsverzeichnis
- 6.3 Literaturverzeichnis
- Danksagung