Die Generierung Antigen-spezifischer B-Lymphozyten ist essentiell für die humorale Immunantwort. Die Aktivierung von B-Zellen ist von Signalen abhängig, die über den B-Zell-Antigenrezeptor (BCR) vermittelt werden. Cytoplasmatische Protein-Tyrosinkinasen (PTKs) sind BCR-proximale Effektorproteine, die cytoplasmatische und transmembrane Adapterproteine wie SLP-65 oder NTAL phosphorylieren. Phosphoryliertes SLP-65 bildet das Gerüst für die Assemblierung und Aktivierung eines Proteinkomplexes, der die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern initiiert. Dieser Ca2+-Initiationskomplex besteht mindestens aus Brutons Tyrosinkinase (Btk) und Phospholipase C-[gamma]2 (PLC-[gamma]2). Die BCR-induzierte Ca2+-Mobilisierung beinhaltet sowohl die Freisetzung aus intrazellulären Ca2+-Speichern als auch den Einstrom über die Plasmamembran. Das Ausmaß der Ca2+-Mobilisierung aus diesen beiden Speichern hängt von dem Entwicklungsstadium des B-Lymphozyten ab. Die räumliche und zeitliche Veränderung von Ca2+-Profilen kann zu verschiedenen B-Zell-Antworten führen, d.h. Proliferation, Differenzierung, Anergie oder Apoptose. Gegenwärtig sind zentrale Fragen in der BCR-induzierten Ca2+-Mobilisierung: (1) wie wird der Ca2+-Initiationskomplex an die Membran rekrutiert, (2) was ist der exakte Mechanismus der BCR-vermittelten PLC-[gamma]2 Aktivierung, (3) wie ist die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung mit dem Ca2+-Einstrom über die Plasmamembran verbunden, und (4) wie erfolgt die differentielle Regulierung der Ca2+-Mobilisierung während der B-Zell-Lymphopoese? In dieser Studie wurden diese Fragen mittels zielgerichteter Gen-Inaktivierung und nachfolgenden Rekonstitutionen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass der SH2/SH3-Adapter Grb2 die Ca2+-Mobilisierung aus intra- und extrazellulären Quellen negativ reguliert. Diese Funktion ist von der zentralen SH2- und der C-terminalen SH3-Domäne abhängig. Tyrosin-phosphoryliertes NTAL wirkt dieser Funktion durch die Grb2-Rekrutierung in lipid rafts entgegen. Es konnte des weiteren gezeigt werden, dass das NTAL/Grb2-Modul nicht den Phosphorylierungsgrad der zentralen Komponenten des Ca2+-Initiationskomplexes, d.h. SLP-65 oder PLC-[gamma]2, beeinflusst. Allerdings scheinen NTAL/Grb2 die PLC-[gamma]2-Aktivierung und/oder dessen Retention an der Plasmamembran zu kontrollieren. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit herausgefunden werden, dass das Hauptphosphoprotein in DT40 das Grb2-Effektorprotein ist. Nachfolgend wurde dieses als das cytosolische Adapterprotein Dok-3 identifiziert. Die Phosphorylierung von Dok-3 durch Lyn ist abhängig von Grb2 und benötigt dessen zentrale SH2- und die C-terminale SH3-Domäne. Zusammenfassend deuten diese Studien darauf hin, dass Grb2 ein molekularer Schalter in der BCR-induzierten Ca2+-Mobilisierung ist. Die SH2-Domänen-abhängige Bindung von Grb2 an entweder Tyrosin-phosphoryliertes NTAL oder Dok-3 führt letztendlich zur positiven bzw. negativen Modulation der Antigenrezeptor-induzierten Ca2+-Mobilisierung in B-Zellen. In dieser Studie wurde ein neuer Ca2+-Regulationsmechanismus identifiziert. Die Adapter-vermittelte Modulation der Ca2+-Mobilisierung könnte durch die Unterstützung von entweder Aktivierung oder Toleranzinduktion die B-Zell-Signaltransduktion kritisch beeinflussen.

The generation of antigen-specific B lymphocytes is essential for the humoral immune response. B cell activation depends on signals generated upon engagement of the B cell antigen receptor (BCR). Proximal BCR effector proteins are cytoplasmic protein tyrosine kinases (PTKs) which phosphorylate cytoplasmic and transmembrane adaptor proteins such as SLP-65 or NTAL, respectively. Phosphorylated SLP-65 forms the scaffold for the assembly and activation of a protein complex which initiates Ca2+ release from intracellular stores. This Ca2+ initiation complex is composed of at least Bruton's tyrosine kinase (Btk) and phospholipase C-[gamma]2 (PLC-[gamma]2). BCR-induced Ca2+ mobilization arises by both release from intracellular Ca2+ stores, and Ca2+ influx through plasma membrane channels. The extent of Ca2+ mobilization from these two sources varies depending on the developmental stage of the B lymphocyte. Shaping Ca2+ profiles in the dimensions of space and time can determine different B cell responses, i.e. proliferation, differentiation, anergy or apoptosis. Currently, central questions of BCR-induced Ca2+ mobilization are: (1) how the Ca2+ initiation complex is targeted to the plasma membrane, (2) what is the exact mechanism of BCR-triggered PLC-[gamma]2 activation, (3) how the intracellular Ca2+ release is connected to Ca2+ influx across the plasma membrane, and (4) how Ca2+ mobilization is differentially regulated during B cell lymphopoiesis. In this study, these questions were addressed by gene targeting experiments and subsequent reconstitutions in the chicken B cell line DT40. It was demonstrated that the SH2/SH3 adaptor Grb2 negatively regulates Ca2+ mobilization from intra- and extracellular sources. This function depends on the central SH2 and the C-terminal SH3 domain. Tyrosine-phosphorylated NTAL counter-acts Grb2 by recruiting it into lipid rafts. It was further shown that the NTAL/Grb2 module does not affect the phosphorylation state of the central components of the Ca2+ initiation complex, i.e. SLP-65 or PLC-[gamma]2. However, it appeared that PLC-[gamma]2 activation and/or retention at the plasma membrane are controlled by NTAL/Grb2. The downstream effector of Grb2 was determined to be the major tyrosine phosphorylated protein in DT40 B cells, and was subsequently identified as the cytosolic adaptor Dok-3. Phosphorylation of Dok-3 by Lyn depends on Grb2 and requires its central SH2 and C-terminal SH3 domain. Collectively, Grb2 seems to be a molecular switch in BCR-induced Ca2+ mobilization. The SH2 domain-dependent binding of Grb2 to either tyrosine phosphorylated NTAL or Dok-3 ultimately leads to positive or negative modulation of antigen receptor-induced Ca2+ mobilization in B cells. Thus, in this study a novel Ca2+ regulation pathway in B lymphocytes was identified. The adaptor-mediated modulation of Ca2+ mobilization may critically influence B cell signalling by supporting either activation or tolerance induction.