Zur Seitenansicht

Titelaufnahme

Zugriffsbeschränkung
  •  Das Dokument ist frei verfügbar
Links
  • Social Media
     
     Share
  • Nachweis
    Kein Nachweis verfügbar
  • IIIF
Dateien
Klassifikation
Zusammenfassung
  • Endotheline sind vasoaktive Peptidhormone, die über die Stimulation der beiden
    G-Protein-gekoppelten Endothelin-Rezeptor-Subtypen A und B die Aktivierung der
    Phospholipase C (PLC) und somit einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration
    induzieren. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (G protein coupled receptors, GPCRs)
    unterliegen einer fein abgestimmten Regulation, um einer Überstimulation der Zelle
    vorzubeugen. Der klassische Desensibilisierungsmechanismus beinhaltet die Phosphorylierung
    des aktivierten Rezeptors durch GPCR-Kinasen (GRKs). Eine Phosphorylierung
    durch diese Serin/Threonin-Kinasen erhöht die Affinität des Rezeptors zu Arrestin,
    welches daraufhin bindet und zu einer sterischen Blockade und somit zur Entkopplung
    des Rezeptors vom G-Protein führt. Die Rezeptor-Phosphorylierung spielt für viele GPCRs
    ebenfalls eine Rolle in der Agonisten-induzierten Rezeptor-Endozytose (Internalisierung).
    Im Endothelin A (ETA)-Rezeptor sind 15 Phosphorylierungsstellen (13 hiervon
    Serin/Threonin-Reste) bekannt, die sich hauptsächlich in der Sequenz, die der
    C-terminalen Palmitoylierungsstelle folgt, befinden. Diese Sequenz (im Folgenden als
    C-terminale Extremität (CTE) bezeichnet) enthält drei Serin- und sieben Threonin-Reste.
    Sechs dieser zehn Phosphorylierungsstellen befinden sich in einem proximalen, vier in
    einem distalen Cluster.
    In der vorliegenden Arbeit wurde die Desensibilisierung des ETA-Rezeptors untersucht. Ob
    die GRK2, deren Beteiligung an diesem Prozess bekannt ist, hier die Funktion einer Kinase
    einnimmt und welche Phosphorylierungsstellen gegebenenfalls involviert sind, ist nicht
    eindeutig geklärt. Daher wurden durch den Austausch von Serin und Threonin gegen
    Alanin phosphorylierungsdefiziente ETA-Rezeptoren hergestellt und in der Zelllinie
    HEK 293 transient exprimiert. Während kontinuierlicher Endothelin-1 (ET-1)-Stimulation
    wurde die PLC-Aktivität analysiert, um Aufschluss über die Regulation der phosphorylierungsdefizienten
    ETA-Rezeptor-Mutanten zu erhalten.
    Die kombinierte Substitution der in der CTE befindlichen Serin/Threonin-Reste, jedoch
    nicht die Substitution aller proximalen oder aller distalen Phosphorylierungsstellen, führte
    zu einer gestörten Desensibilisierung, was sich in einer Erhöhung des PLC-Signals unter
    kontinuierlicher ET-1-Stimulation manifestierte. Für eine physiologische Desensibilisierung
    schien das Vorhandensein mindestens eines intakten Serin/Threonin-Clusters
    obligatorisch zu sein, denn die PLC-Aktivität jeder untersuchten Mutante mit einer
    Kombination aus proximalen und distalen Substitutionen war gegenüber der PLC-Aktivität
    des Wildtyps signifikant erhöht.
    Des Weiteren wurde die ET-1-induzierte PLC-Aktivität von Zellen untersucht, die den
    ETA-Rezeptor und GRK2 transient koexprimierten. Neben der wildtypischen Kinase
    (GRK2-WT) kamen die beiden Mutanten GRK2-D110A und GRK2-D110A/K220R zum
    Einsatz. Die Mutation K220R wurde gewählt, da sie in einer katalytisch inaktiven GRK2
    resultiert. Die Mutation D110A beeinträchtigt hingegen die Bindung von GRK2 an Gαq. Die
    rekombinante Expression von GRK2-WT führte sowohl beim wildtypischen ETA-Rezeptor
    (ETA-WT) als auch bei der phosphorylierungsdefizienten Mutante ETA-6PD (mit einer
    Kombination aus proximalen und distalen Substitutionen) zu einer Reduktion der
    PLC-Aktivität. Durch eine Expression von GRK2-D110A wurde die ETA-WT-, jedoch nicht
    die ETA-6PD-vermittelte PLC-Aktivität inhibiert. Beide Signale waren von einer GRK2-
    D110A/K220R-Expression unbeeinträchtigt. Diese Ergebnisse belegen, dass in die
    Desensibilisierung des ETA-Rezeptors mindestens zwei unabhängige GRK2-vermittelte
    Komponenten involviert sind: 1) ein phosphorylierungsunabhängiger Mechanismus, der
    durch die Bindung der Kinase an Gαq realisiert wird und 2) ein Mechanismus, der die
    Phosphorylierung von Serin/Threonin-Resten in der CTE des Rezeptors beinhaltet und in
    redundanter Weise in der Lage ist, entweder proximale oder distale Phosphorylierungsstellen
    zu involvieren. Das Vorhandensein eines phosphorylierungsabhängigen Desensibilisierungsmechanismus
    konnte durch GRK2-Knockdown-Experimente bestätigt werden.
    In HEK 293-Zellen wurde zusätzlich die Internalisierung von ETA-WT und einer Mutante,
    bei der alle bekannten Serin- und Threonin-Phosphorylierungsstellen entfernt wurden,
    untersucht. Hierfür wurden die auf der Zelloberfläche exprimierten Rezeptoren mit HiLyte
    Fluor 488-gekoppeltem ET-1 markiert. Die Internalisierung der fluoreszenzmarkierten
    Rezeptoren wurde im konfokalen Laser Scanning-Mikroskop beobachtet. Es wurden keine
    Unterschiede in der Endozytosegeschwindigkeit des wildtypischen und des phosphorylierungsdefizienten
    Rezeptors festgestellt. Dies lässt den Schluss zu, dass die
    Internalisierung des ETA-Rezeptors phosphorylierungsunabhängig geschieht.
    Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse deuten auf eine komplexe ETA-Rezeptor-
    Regulation hin. Die gleichzeitige Beteiligung von phosphorylierungsabhängigen
    und -unabhängigen Komponenten an der Desensibilisierung und Internalisierung geht
    über das klassische Paradigma der GPCR-Regulation hinaus und könnte im Zusammenhang
    mit einer Zelltyp-spezifischen Feinabstimmung des Endothelin-Signals stehen.
Abstract
  • The vasoactive peptide hormones of the endothelin family activate phospholipase C (PLC)
    via stimulation of the G protein coupled endothelin A and B receptors to induce an
    increase of the intracellular Ca2+ concentration. G protein coupled receptors (GPCRs) are
    tightly regulated to prevent cellular overstimulation. A well-known desensitization
    mechanism involves the phosphorylation of the activated receptor by GPCR kinases
    (GRKs). Phosphorylation of the receptor by these serine/threonine kinases promotes
    binding of arrestin to the receptor which subsequently is uncoupled from its G protein by
    steric inhibition. Receptor phosphorylation is also involved in the agonist induced
    receptor endocytosis (internalization) of many GPCRs. The endothelin A (ETA) receptor
    contains 15 confirmed phosphorylation sites (including 13 serine/threonine residues)
    which are essentially located in the sequence following the C-terminal palmitoylation site.
    This sequence is subsequently referred to as C-terminal extremity (CTE). It contains three
    serine and seven threonine residues which are located in a proximal cluster (including six
    phosphorylation sites) and a distal cluster (including four phosphorylation sites).
    In this work the desensitization of the ETA receptor was analyzed. Involvement of GRK2 in
    this process was shown in previous studies. Unclear however is whether GRK2 acts as a
    kinase in this process or rather mediates ETA receptor desensitization in a
    phosphorylation independent way. Furthermore, in the case of a phosphorylation
    dependent desensitization mechanism, the phosphorylation sites are unknown.
    Therefore, various phosphorylation deficient ETA receptor mutants were created by
    substitution of serine/threonine-phosphoacceptor sites by alanine in different
    combinations. The phospholipase C (PLC) activity of mutant receptors transiently
    expressed in HEK-293 cells was analyzed during continuous endothelin-1 (ET-1)
    stimulation to gain information about their regulation and an involvement of
    phosphorylation in this process.
    The total deletion of phosphoacceptor sites in the CTE affected receptor regulation
    resulting in an increased PLC activity during continuous ET-1 stimulation. However,
    proximal as well as distal Serine/Threonine-phosphoacceptor sites both turned out to be
    sufficient to induce wild type-like desensitization. In this context, the integrity of either
    the proximal or the distal phosphoacceptor cluster seemed to be mandatory for the wild
    type-like desensitization because the second messenger production of any investigated
    ETA receptor containing combined substitutions of proximal and distal Serine/Threoninephosphoacceptor
    sites was significantly increased.
    Additionally, the ET-1 induced PLC activity of cells transiently coexpressing the ETA
    receptor and GRK2 was analyzed. Besides the wild type GRK2 (GRK2-WT) the mutants
    GRK2-D110A and GRK2-D110A/K220R were used. The mutation K220R was chosen
    because it results in the loss of kinase activity. The mutation D110A affects GRK2’s
    coupling to Gαq. Recombinantly expressed GRK2-WT decreased the PLC activity mediated
    by both the wild type ETA receptor (ETA-WT) and the phosphorylation deficient mutant
    ETA-6PD containing proximal and distal substitutions. The expression of GRK2-D110A
    suppressed ETA-WT signaling but did not impact PLC activity mediated by the
    phosphorylation-deficient mutant ETA-6PD. Moreover, GRK2-D110A/K220R failed to
    inhibit signaling of ETA-WT and ETA-6PD. This demonstrates that ETA desensitization
    involves at least two autonomous GRK2-mediated components: 1) a phosphorylationindependent
    signal decrease mediated by blocking of Gαq and 2) a mechanism involving
    phosphorylation of serine and threonine residues in the CTE of the receptor in a
    redundant fashion, able to incorporate either proximal or distal phosphoacceptor sites.
    The existence of a phosphorylation dependent mechanism of desensitization was
    confirmed by GRK2 knockdown experiments.
    Furthermore, the internalization of ETA-WT and a mutant lacking all known
    serine/threonine phosphorylation sites were analyzed. For this purpose, receptors
    expressed on the cell surface were labeled by the addition of HiLyte Fluor 488 coupled
    ET-1. The internalization of fluorescently labeled receptors was observed by confocal
    laser scanning microscopy. No differences in the kinetics of endocytosis of the wild type
    and the phosphorylation deficient receptors were detected. This suggests a
    phosphorylation independent internalization mechanism for the ETA receptor.
    The results of this work hint at a complex regulation of ETA receptor signaling. The
    coexistence of diverse phosphorylation-dependent and -independent components of
    desensitization and internalization exceeds the classical paradigm of GPCR regulation and
    may be associated with cell specific fine-tuning of endothelin signaling.
Statistik
  • Das PDF-Dokument wurde 4 mal heruntergeladen.