Kranick, Daniel; Kranick, Daniel Sebastian: Identifizierung und Charakterisierung von CREM-Spleißvarianten im murinen und humanen Herzen. 2016
Inhalt
- 1 Einleitung
- 1.1 Herzinsuffizienz
- 1.2 Kardiales Remodelling und veränderte Genexpression bei Herzinsuffizienz
- 1.3 Transkriptionelle Regulation durch cAMP
- 2 Zentrale Fragestellungen
- 3 Material und Methoden
- 3.1 Vorgehensweise
- 3.2 Ausgangsmaterial
- 3.3 Identifikation der CREM-Spleißvarianten
- 3.3.1 Reverse-Transkriptase PCR
- 3.3.2 Polymerasekettenreaktion
- 3.3.3 5‘-Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR
- 3.3.4 Agarosegelelektrophorese
- 3.3.5 Aufreinigung der cDNA aus Agarosegelen
- 3.3.6 Herstellung kompetenter Escherichia coli nach der Rubidiumchlorid-Methode
- 3.3.7 Klonierung der cDNA in einen prokaryotischen Expressionsvektor
- 3.3.8 Transformation der Plasmide in Escherichia coli
- 3.3.9 Bakterienkultur zur Vermehrung der Plasmide
- 3.3.10 Plasmidextraktion durch alkalische Lyse
- 3.3.11 Restriktionsverdaus zur Validerung der Inserts
- 3.3.12 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration und Verdünnung
- 3.3.13 Sequenzierung der Spleißvarianten
- 3.4 Klonierung von CREM-Spleißvarianten in eukaryotische Expressionsvektoren
- 3.4.1 PCR Site-directed Mutagenesis der CREM-cDNA
- 3.4.2 Linearisierung des eukaryotischen Expressionsvektors
- 3.4.3 Aufreinigung der PCR Site-directed Mutagenesis und des linearisierten Vektors mit DNA Clean & Concentrator™-5
- 3.4.4 Restriktionsverdau und Aufreinigung der mutierten CREM-cDNA
- 3.4.5 Abschätzen von DNA-Konzentrationen auf Agarosegelen
- 3.4.6 Klonierung der CREM-Spleißvarianten in den eukaryotischen Expressionsvektor
- 3.4.7 Vermehrung der Vektoren in Escherichia coli mit anschließender Plasmidextraktion
- 3.4.8 Restriktionsverdau und Sequenzierung der Vektoren zur Verifikation des Inserts
- 3.5 Nachweis der CREM-Expression durch SDS-PAGE und Western Blot
- 3.5.1 Kultur und Transfektion von HEK293-Zellen
- 3.5.2 Aufbereitung der Zellen durch Sonifizieren
- 3.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford
- 3.5.4 SDS-PAGE und Western-Blot
- 3.5.5 Darstellung der Proteine mit dem ChemiDocTM MP Imaging System
- 3.6 Funktionelle Charakterisierung von CREM-Spleißvarianten im Luciferase-Assay
- 3.6.1 Kultur und Transfektion von HEK293-Zellen
- 3.6.2 Stimulation der transfizierten HEK293-Zellen mit Forskolin
- 3.6.3 Luciferase-Reportergen-Analyse mit Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader
- 3.7 Quantitative Analyse von CREM-Spleißvarianten durch quantitative-Real-Time-PCR
- 4 Ergebnisse
- 4.1 Identifikation von CREM-Spleißvarianten
- 4.1.1 Identifizierte CREM-Spleißvarianten im Herzen der Maus
- 4.1.2 Identifizierte CREM-Spleißvarianten im Herzen des Menschen
- 4.1.3 Translation der CREM-Isoformen
- 4.2 Quantifizierung der CREM-Spleißvarianten
- 4.2.1 Isoformen im Herzen der Maus im physiologischen Zustand und unter Isoprenalinstimulation
- 4.2.2 Isoformen in nicht-insuffizienten, humanen Herzen und insuffizienten Herzen von DCM-Patienten
- 4.3 Luziferase-Reportergen-Analyse von CREM-Isoformen
- 5 Diskussion
- 5.1 Beschreibung der Spleißvarianten
- 5.1.1 Spleißvarianten, die ausgehend von P1/P5 transkribiert werden
- 5.1.1.1 Spleißvarianten, die eine Kinase Inducible Domain enthalten
- 5.1.1.2 Spleißvarianten ohne (vollständige) KID
- 5.1.1.3 Spleißvarianten mit transaktivatorischer Domäne
- 5.1.2 Spleißvariante, die ausgehend von P4 transkribiert wird
- 5.1.3 ICER-Spleißvarianten
- 5.1.4 smICER-Spleißvarianten
- 5.2 Ausblick
- 6 Zusammenfassung
- 7 Literaturverzeichnis
- 8 Abbildungsverzeichnis
- 9 Tabellenverzeichnis
- 10 Danksagung
- 11 Lebenslauf